Detailliertes Protokoll für die Inhalte der DNA Flow Cytometry

Admin Juli 26, 2015 Ausbildung 88 0
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Durchflusszytometrie ist eine wissenschaftliche Methode Durchflusszytometer auf den DNA-Gehalt in einer Zelle zu bestimmen, verwendet. Diese Informationen werden von Wissenschaftlern verwendet werden, um zu bestimmen, in welcher Phase des Zellzyklus aus einer Population von Zellen, wie Ruhe, Interphase und Mitose und Interphase weiter in 3 Phasen (G1, S und G2) geteilt ist. Es wird auch verwendet, um den Prozentsatz von Zellen, die Apoptose (Tod) sind, oder DNA-Ploidie (Chromosomengehalt) zu bestimmen. Alle Maschinen und Komponenten in diesem Protokoll verwendet werden, erfordern umfangreiche wissenschaftliche Know-how und Ausbildung. Auf keinen Fall sollte von einem Laien oder Nicht-Wissenschaftler versucht werden.

Bestimmen Sie den Zweck des Experiments

Der Zweck des Durchführens einer Analyse des DNA-Gehalts durch Fließzytometrie Protokoll werden die tatsächlichen Anforderungen zu bestimmen. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass es Hunderte von verfügbaren Protokolle für die Analyse von DNA-Gehalt. Dieses Protokoll ist eine grundlegende Untersuchung der Ethanol-fixierten Zellen mit dem DNA-bindenden Farbstoff angefärbt, propiridum Iodid. Weil es ein relativ einfaches Protokoll kann eine beliebige Anzahl von Variationen und Modifikationen vorgenommen werden, um einen bestimmten Zelltyp oder Analyseverfahren geschaffen werden. Für lebende Zellen oder die Verwendung von anderen Reagenzien, wie Detergenzien, Protease, Flecken 4 ', 6-dianidino-2-phenylindol oder andere Fixiermittel, entsprechend ändern das Protokoll.

Die Zellen sollten für die Analyse gesammelt werden

Die Zellen werden in PBS gewaschen, um Zelltrümmer zu entfernen und dann durch Schleudern in einer Zentrifuge bei 200 g für 5 Minuten pelletiert. Dies ergibt eine überstehende Flüssigkeit verworfen. Das Pellet wird in 0,5 ml PBS resuspendiert und auf und ab pipettieren, bis es vollständig entflochten. Klumpen von Zellen oder Dubletten können die Durchflusszytometer verstopfen und nicht richtig zu färben. Eine allgemeine Regel für die Durchflusszytometrie ist, um die Konzentration der Zellen für 10 ~ 10 ~ 6 oder 7-Zellen in 5 ml PBS erhalten.


Fleck Propidiumiodid

Dies wird während der Fixierung oder im Voraus und teilen durch Einfrieren vorbereitet. Es wird durch Mischen von 2 mg RNase A mit 200 ul von 1 mg/ml Propidiumiodid in 10 ml 0,1% Triton-X100 hergestellt. Die RNase A verhindert den Abbau Abbau von Ribonukleinsäuren in der Probe, während der Triton-X100 ist ein Reinigungsmittel, das die Zellmembran permeabilisiert, und dann können die Propidiumiodid-Färbung in die Zelle eindringen können.

werden die Zellen mit Propidiumiodid angefärbt

Abhängig von der Anzahl der Zellen, ist 1 ml Farbstoff für die meisten der Proben in der Regel ausreichend. Die Zellen werden pelletiert und in PBS gewaschen, um alle der Fixierungslösung zu entfernen, dann in 1 ml Propidiumiodid-Färbung resuspendiert. Die Färbung wird während 30 Minuten bei Raumtemperatur oder 15 Minuten bei 37 Grad Celsius stattfindet. Es ist wichtig, die Zellen bedeckt oder Propidiumiodid im Dunkeln zu halten, weil sie lichtempfindlich ist.

Analyse

Celluar mittels Durchflusszytometrie

Die gefärbten Zellen werden pelletiert und in PBS gewaschen, dann in bis zu 1 ml PBS resuspendiert. Die Zellen können in Kontakt mit dem Durchflusszytometer gebracht und unter Verwendung eines Langpassemissionsfilter an Propidiumiodid erkennen analysiert. Jede Fluoreszenz durch den Fleck emittiert wird, durch Erfassen der Pulsbreitenpulssignalbereich gemessen. Dies unterscheidet Zellen, Zellzyklus in der G2/M Phase sind, von Zelle Dubletten (oder eingefügten Zellen), die aus ihrer Unterdrückung der Bevölkerung entfernt. Die Datenproben werden gesammelt und unter Verwendung eines DNA-Frequenzgehalt Entfaltungs Software wie ModFit oder Multicycle analysiert.

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